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葉綠素含量測定
根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收,利用分光光度計在某一特定波長下測定其光密度,即可用公式計算出提取液中各色素的含量。其中分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
根據(jù)朗伯—比爾定律,某有色溶液的光密度D與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比,即:
D=kCL。式中:k為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位,液層厚度為
如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì),則此混合液在某一波長下的總光密度等于各組分在相應(yīng)波長下光密度的總和,這就是光密度的加和性。測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量,只需測定該提取液在三個特定波長下的光密度D,并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾,所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。
已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm,又知在波長663nm下,葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27,在波長645nm下分別為16.75和45.60,可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式:
D663 = 82.04Ca+9.27Cb (1)
D645 = 16.75Ca+45.60Cb (2)
式(1)、(2)中的D663和D645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時的光密度,Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度,以mg/L為單位。解方程組(1)、(2),得:
Ca = 12.72D663 – 2.59D645 (3)
Cb = 22.88D645 – 4.67D663 (4)
將Ca與Cb相加即得葉綠素總量(CT):
CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663 (5)
另外,由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交,兩者有相同的比吸收系數(shù)(均為34.5),也可以在此波長下測定一次光密度(D652)而求出葉綠素a、b總量:
CT =(D652 × 1000)/ 34.5 (6)
在有葉綠素存在的條件下,用分光光度法可同時測定出溶液中類胡蘿卜素的含量。
Lichtenthaler等對Arnon法進(jìn)行了修正,提出了80%丙酮提取液中三種色素含量的計算公式:
Ca = 12.21D663 – 2.81D646 (7)
Cb = 20.13D646 – 5.03D663 (8)
Cx·c=(1000D470 – 3.27Ca – 104Cb)/ 229 (9)
式中:Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度;Cx·C為類胡蘿卜素的總濃度;D663、D646和D470分別為葉綠體色素提取液在波長663nm、646nm和470nm下的光密度。
由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異,因此,在使用其他溶劑提取色素時,計算公式也有所不同。葉綠素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm,類胡蘿卜素為470nm,可據(jù)此列出以下關(guān)系式:
Ca = 13.95D665 – 6.88D649 (10)
Cb = 24.96D649 – 7.32D665 (11)
Cx·c=(1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb)/ 245 (12)
葉綠素a的測定可通過在線測葉綠素a儀器,或者實驗室型的熒光法測葉綠素a儀器。而葉綠素?zé)晒鉁y定儀更適合湖泊、水庫葉綠素a的測定。Turner Designs公司提供的Aquafluor手持式葉綠素?zé)晒鉁y定儀有兩種通道可以選擇:活體葉綠素a;藍(lán)綠藻(藻紅蛋白或藻藍(lán)蛋白);濁度;若丹明WT;熒光素;銨;和萃取葉綠素a。
而普通型的葉綠素測定儀,只需你把葉子夾在葉綠素儀中,然后通過按鈕就可看到葉綠素含量的值,方便又簡單。
圖 葉綠素測定儀
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