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蛋白質測定方法
蛋白質測定方法一般來說,有以下五種:凱氏定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法和考馬斯亮藍法(Bradford法)。
表 五種蛋白質測定方法的比較
方法
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靈敏度
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時間
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原理
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干擾物質
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說明
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凱氏定氮法
(Kjedahl法)
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靈敏度低,適用于0.2~ 1.0mg氮,誤差為 ±2%
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費時
8~10小時
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將蛋白氮轉化為氨,用酸吸收后滴定
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非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白質而分離)
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用于標準蛋白質含量的準確測定;干擾少;費時太長
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雙縮脲法(Biuret法)
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靈敏度低
1~20mg
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中速
20~30分鐘
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多肽鍵+堿性Cu2+®紫色絡合物
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硫酸銨;
Tris緩沖液;
某些氨基酸
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用于快速測定,但不太靈敏;不同蛋白質顯色相似
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紫外吸收法
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較為靈敏
50~
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快速
5~10分鐘
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蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收
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各種嘌吟和嘧啶;
各種核苷酸
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用于層析柱流出液的檢測;核酸的吸收可以校正
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Folin-酚試劑法(Lowry法)
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靈敏度高
~
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慢速
40~60
分鐘
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雙縮脲反應;磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原
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硫酸銨;
Tris緩沖液;
甘氨酸;
各種硫醇
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耗費時間長;操作要嚴格計時;
顏色深淺隨不同蛋白質變化
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考馬斯亮藍法(Bradford法)
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靈敏度最高
1~
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快速
5~15分鐘
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考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時,其lmax由465nm變?yōu)?95nm
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強堿性緩沖液;
TritonX-100;
SDS
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最好的方法;
干擾物質少;
顏色穩(wěn)定;
顏色深淺隨不同蛋白質變化
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從以上表格中可以得出,不同的方法有不同的特點和優(yōu)勢,如紫外吸收法測定時間快。但是綜合起來,最后一種考馬斯亮藍法(Bradford法)效率最高,無論是測定時間,靈敏度還是受干擾程度,都是比較占優(yōu)勢的。
下面,我們來重點介紹一下其中一種蛋白質測定方法--凱氏定氮法。
凱氏定氮法(Kjedahl法)
首先將濃硫酸倒入樣品中,邊倒邊搖晃,以使?jié)饬蛩崤c樣品充分接觸,然后加熱試劑。如果你需要加快實驗進度,可以加入CuSO4作催化劑,這樣,實驗的反應時間就會大大縮短。CH2COOH和H2SO4反應生成氨氣,然后氨氣又與H2SO4發(fā)生作用,固定了氮元素。這時我們得到了(NH4)2SO4的溶液,然后我們可以用NaOH去跟硫酸銨反應,通過計算NaOH的使用量,就可以計算出氮的含量。下面是整個定氮法中發(fā)生的化學反應。
CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
當我們得到氮的含量以后,我們就可以通過一定的計算,最終算出蛋白質的含量。
凱氏定氮法常用于有機化合物中的氮含量的測定,是蛋白質含量測定的經(jīng)典方法,雖然在測試過程中,試劑用量很大,但是,不可否認,它所適用的樣品范圍之廣,測試結果之精確,都是公認的。
現(xiàn)在,隨著科技的發(fā)展,我們已經(jīng)研究出帶消化爐的凱氏定氮儀,它把定氮過程中的前兩步驟通過儀器完成,方便了整個過程的實施。凱氏定氮儀能夠自動的對樣品進行消化,然后蒸餾,智能化完成,節(jié)省了時間和精力,提高了工作效率。這種蛋白質測定方法具有有準確、快速、簡便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點。浙江托普儀器有限公司提供這種產品,24小時服務熱線:0571-87515059。
圖 凱氏定氮儀
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