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葉綠素a的測(cè)定

來(lái)源: 中國(guó)農(nóng)業(yè)儀器網(wǎng)  類別:技術(shù)文章  更新時(shí)間:2009-08-31  閱讀次
 

      葉綠素廣泛存在于果蔬等高等綠色植物中,與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠體。高等植物中葉綠素有兩種:葉綠素a和葉綠素b。這兩種葉綠素都溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機(jī)物。葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的必需因子,在光合作用中起到吸收和傳遞光能的作用。其中葉綠素a的分子式為C40H70O5N4Mg,葉綠素a的分子結(jié)構(gòu)由4個(gè)吡咯環(huán)通過(guò)4個(gè)甲烯基(=CH—)連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),稱為卟啉(環(huán)上有側(cè)鏈)。卟啉環(huán)中央結(jié)合著1個(gè)鎂原子,并有一環(huán)戊酮(Ⅴ),在環(huán)Ⅳ上的丙酸被葉綠醇(C20H39OH)酯化、皂化后形成鉀鹽具水溶性。在酸性環(huán)境中,卟啉環(huán)中的鎂可被H取代,稱為去鎂葉綠素,呈褐色,當(dāng)用銅或鋅取代H,其顏色又變?yōu)榫G色,此種色素穩(wěn)定,在光下不退色,也不為酸所破壞,浸制植物標(biāo)本的保存,就是利用此特性。

利用分光光度計(jì)進(jìn)行葉綠素a的測(cè)定,是最普通的測(cè)量葉綠素a的方法。利用分光光度計(jì),首先測(cè)定葉綠素提取液在最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值,葉綠素a在645nm和665nm處有最大的吸光值。然后利用朗伯—比爾定律計(jì)算出提取液中各色素的含量。朗伯—比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為A=lg(1/T)=Kbc ,其中A為吸光度;T為透射比,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度;c為吸光物質(zhì)的濃度;b為吸收層厚度。

葉綠素a的測(cè)定過(guò)程

首先介紹下我們?cè)跍y(cè)定過(guò)程中要用到的儀器:分光光度計(jì)、天平、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦境紙、滴管;準(zhǔn)備幾片新鮮的植物葉片;準(zhǔn)備96%的乙醇(或80%丙酮)、石英砂和碳酸鈣粉。

然后具體操作如下:取新鮮植物葉片(或其它綠色組織)或干材料,擦凈組織表面污物,去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2g,放入研缽中,加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95%乙醇,研成均漿,再加乙醇10mL,繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3~5min。取濾紙1張置于漏斗中,用乙醇濕潤(rùn),沿玻棒把提取液倒入漏斗,濾液流至100mL 棕色容量瓶中;用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次,最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小S玫喂芪∫掖迹瑢V紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至100mL,搖勻。取葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)665nm、645nm 和652nm下測(cè)定吸光度,以95%乙醇為空白對(duì)照。

然后根據(jù)資料上提供的葉綠素a的計(jì)算方法,就可算出新鮮的植物葉片葉綠素a的含量。具體公式如下:

葉綠素a=(12.7A665-2.69A645)*(V/1000W)

葉綠素b=(12.7A645-2.69A665)*(V/1000W)

總?cè)~綠素a=(20.0A645+8.02A665)*(V/1000W)  或者總?cè)~綠素a=(A652/34.5)*(V/1000W)

 

 

分光光度計(jì)

另一種葉綠素a的測(cè)定方法—熒光光度法

近年來(lái),海水葉綠素a含量測(cè)定的分光光度法已逐漸被較簡(jiǎn)便且靈敏度高的萃取熒光法代替。其原理是葉綠素a的丙酮萃取液受藍(lán)光激發(fā)后產(chǎn)生紅色熒光,用熒光計(jì)在波長(zhǎng)670nm測(cè)定提取液酸化前后的熒光值,按下式計(jì)算海水葉綠素a的含量:

             (1)

式中,Rb—酸化前熒光值;Ra—酸化后熒光值;R—純?nèi)~綠素a的酸化因子(隨儀器而異)。因 ,故(1)式成為:

                               (2)

式中, Fd—測(cè)定時(shí)熒光計(jì)所用量程的換算因子(mg/m3),其值的確定有幾種方法,具體介紹如下:

⑴標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a校正法:用純?nèi)~綠素a配成母液,把母液稀釋成一系列不同濃度的溶液并分別測(cè)定熒光讀數(shù),最后用直線回歸法算出標(biāo)定線的斜率,即Fd。

⑵分光光度計(jì)校正法:取一定體積處于指數(shù)生長(zhǎng)期的單細(xì)胞藻類,按分光光度法測(cè)定葉綠素a的方法,測(cè)其吸光值E,按公式chl-a = 11.85E664-1.54 E647-0.08 E630 =Cchl-a計(jì)算該提取液的Cchl-a。然后將它在熒光計(jì)上測(cè)定熒光值Rb,按(3)式求得Fd。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計(jì)校正法。

                                                              (3)

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