飼料蛋白質(zhì)含量的測定通常采用國標(biāo)規(guī)定的凱氏定氮法, 但用雙縮脲比色法測定飼料中蛋白質(zhì)含量也有報道( 陳革, 2003) 。本實驗對多種飼料樣品采用雙縮脲比色法進行蛋白質(zhì)含量測定,并將結(jié)果與凱氏定氮法進行對比和分析, 為實際工作中選擇合理的方法進行飼料中蛋白質(zhì)含量的測定提供科學(xué)依據(jù)。

1 雙縮脲法原理

當(dāng)尿素加熱至150 ～160 ℃時, 可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二縮脲( 也叫雙縮脲) 。其反應(yīng)式如下:2H2NCONH2→H2NCONHCONH2 +NH3↑雙縮脲在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色的絡(luò)合物, 此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。含有2 個或2 個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有多個肽鍵( - CO- NH- ) , 在堿性溶液中與銅離子絡(luò)合成紫紅色絡(luò)合物, 在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。據(jù)此可用吸收光度法測蛋白質(zhì)含量, 該絡(luò)合物最大吸收波長為540 nm。

2 實驗材料

2.1 試劑雙縮脲試劑:稱取CuSO4·5H2O 1.5 g,酒石酸鉀鈉(NaKC4O6·4H2O) 6 g, 溶于500 mL 蒸餾水, 在攪拌下加入300 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %NaOH 溶液, 然后用蒸餾水稀釋到1000 mL。配好后貯于塑料瓶中。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液( 7 g/100mL) , 10 %氫氧化鉀溶液: 稱取分析純氫氧化鉀50g 溶于500 mL 蒸餾水中。

2.2 主要儀器 粉碎機; 分樣篩: 孔徑0.45 mm( 40 目) ; 751 紫外/可見分光光度計; 電熱恒溫水浴鍋; 分析天平: 感量0.0001 g; 電爐; 玻璃燒杯;具塞玻璃試管: 25 mL; 容量瓶; 托盤天平，比色計，羅維朋比色計等。

3 測定方法

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液( 7 g/dL) 用0.1 mol/L NaOH 溶液稀釋至4 mg/mL。分別取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液( 4 mg/mL) 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于25 mL 具塞比色試管中, 用蒸餾水補齊至1.0mL, 然后各比色管中加入4.0 mL 雙縮脲試劑, 混勻, ( 37±0.2) ℃保溫30 min。以空白管調(diào)零, 用751 型分光光度計在540 nm 波長, 杯徑1 cm, 測定吸光值。以蛋白質(zhì)含量(mg/mL) 為橫坐標(biāo), 以吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 如圖1 所示。

3.2 飼料中蛋白質(zhì)的測定

3.2.1 樣品來源飼料市場采集的具代表性飼料樣品10 個。

3.2.2 樣品處理將樣品粉碎后經(jīng)40 目篩過濾, 準(zhǔn)確稱取0.2 g( 精確至0.0002 g) 飼料樣品于具塞試管中, 加入10 % KOH 溶液10 mL, 沸水浴30 min, 冷卻后用蒸餾水定容至25 mL, 過濾。取飼料過濾液0.5 mL, 以蒸餾水補齊至1.0 mL, 加4.0 mL 雙縮脲試劑, ( 37±0.2) ℃反應(yīng)30 min。以空白管調(diào)零, 在540 nm 處測定吸光值, 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求得濃度值。計算公式如下:飼料樣品蛋白質(zhì)含量(%) =C×2×25/W×1000。式中, C 為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的濃度值(mg/mL) ;W為飼料樣品重量( g) 。

4 結(jié)果與分析

4.1 不同飼料樣品的對比實驗結(jié)果見表1。從表1 可以看出, 雙縮脲法對飼料蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果與凱氏定氮法測定結(jié)果, 相差較大, 比凱氏定氮法所測值低15.1 %( 5.8 % ～31.7 %) 。孫建平和侯彩云( 2005) 認為雙縮脲法的測定結(jié)果比凱氏法小10 % ～20 %。凱氏定氮法測得的蛋白質(zhì)含量是粗蛋白質(zhì), 即含氮量乘以6.25, 其中包括無機氮和氨基酸。雙縮脲法測得的蛋白質(zhì)含量是真蛋白質(zhì)。是堿溶液所能溶解的蛋白質(zhì), 并且與雙縮脲反應(yīng)轉(zhuǎn)為絡(luò)合物的顯色部分; 而不溶解的那一部分蛋白質(zhì)和雙縮脲試劑的反應(yīng)很少, 即使有反應(yīng), 產(chǎn)生的有色絡(luò)合物經(jīng)過濾并不存在于最終的比色液中。因此, 比色測定中讀出的吸光度值, 只是可溶蛋白質(zhì)形成的有色絡(luò)合物的吸光度值。另外, 飼料中添加的蛋白質(zhì)原料較為復(fù)雜, 有豆粕、花生粕、棉籽餅、菜籽餅、魚粉、羽毛粉等。測定中雖經(jīng)過粉碎、過篩、堿液煮沸, 但有些蛋白質(zhì)仍難溶于測試液中, 與真實值相比產(chǎn)生較大誤差。并且飼料中含有大量的粗纖維, 對于粗纖維含量較高的樣品, 雙縮脲法測定結(jié)果不十分穩(wěn)定。

4.2 在牛奶、豆?jié){、牛血清中的對比實驗結(jié)果見表2。從表2 可以看出, 利用雙縮脲法測定牛奶、豆汁、牛血清蛋白質(zhì)含量與凱氏法測定結(jié)果較為接近, 因為這些樣品中所含蛋白質(zhì)溶解度較高,所含蛋白質(zhì)種類相對較少, 其性質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白液接近。

4.3 雙縮脲法測定飼料蛋白質(zhì)含量精密度實驗對5 號、6 號飼料樣, 分別取6 個樣品用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量, 結(jié)果見表3。從表3 可以看出,雙縮脲法對同一飼料樣品的平行測定結(jié)果, 重現(xiàn)性較好, 精密度較高。符合國標(biāo)規(guī)定蛋白質(zhì)測定結(jié)果的相對偏差范圍, 但平均值與凱氏法結(jié)果差距較大。

5 小結(jié)

雙縮脲法測定飼料蛋白質(zhì)雖然不經(jīng)消化, 不產(chǎn)生有害氣體, 但并不省時。飼料中淀粉經(jīng)堿溶液及加熱處理而糊化, 難以過濾, 尤其配合料淀粉含量高, 2 h 只能過濾1 ～2 mL( 濃縮料相對較快) ,且此法受工作環(huán)境( 溫度等) 影響較大, 若每次作標(biāo)準(zhǔn)曲線就更費時。飼料中成分復(fù)雜, 某些離子對顯色反應(yīng)會產(chǎn)生影響, 這也是結(jié)果不穩(wěn)定的原因。

綜上所述, 雙縮脲法不適于配合飼料和濃縮飼料蛋白質(zhì)含量的測定。