SSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在構(gòu)建玉米DNA指紋庫上的應(yīng)用

康麗麗 周鴻飛(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院)

玉米是一種重要的飼用、糧用和工業(yè)加工作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。玉米育種方法的改進(jìn)對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。長期以來，育種家們大多數(shù)是借用易于鑒別的形態(tài)學(xué)和同工酶等遺傳標(biāo)記來輔助育種，并取得了很大成功。但這類標(biāo)記的最大不足之處在于其數(shù)量有限，要找到與目標(biāo)性狀密切相關(guān)的標(biāo)記往往很困難，難以應(yīng)用于育種實(shí)踐。因此，育種家們一直希望能夠找到一類數(shù)量豐富、選擇效應(yīng)高的標(biāo)記，以提高育種效率和育種過程的預(yù)見性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，開發(fā)了基于DNA變異的分子標(biāo)記。應(yīng)用最廣泛的主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP等，其中SSR標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記，重復(fù)性好，可靠性高，分析簡便，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且靈敏度高，檢測(cè)遺傳變異的能力強(qiáng)。近年來，SSR標(biāo)記在玉米育種中得到了廣泛的應(yīng)用。

1 SSR標(biāo)記

1．1 SSR標(biāo)記的原理

簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat.SSR)，又稱為微衛(wèi)DNA(Microsatellite DNA)。微衛(wèi)星通常是指以2—4個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，也有少數(shù)以l一6個(gè)核苷酸為串聯(lián)重復(fù)單位。微衛(wèi)星在基因組中的分布是隨機(jī)的，它可以存在于內(nèi)含子、外顯子及染色體的其它任何區(qū)域。在不同植物中，微衛(wèi)星重復(fù)單位的堿基組成及拷貝數(shù)隨物種的不同而有所差異，但人們發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星兩端的序列是保守的。因此，可以設(shè)計(jì)出與微衛(wèi)星兩端保守序列互補(bǔ)的引物，通過PCR擴(kuò)增重復(fù)序列本身并通過凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性。SSR序列多態(tài)性的出現(xiàn)是由于同一物種中不同基因型的寡核苷酸重復(fù)次數(shù)不同以及重復(fù)序列在染色體復(fù)制時(shí)的滑動(dòng)或染色單體的不等交換造成的。因此，微衛(wèi)星可用作分子標(biāo)記。由于玉米中存在轉(zhuǎn)座子，微衛(wèi)星的多態(tài)性表現(xiàn)得極為豐富，所以，通過特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳(或聚丙烯酰胺凝膠電泳)、放射自顯影(或銀染)和GeneScan技術(shù)等，就可以檢測(cè)到在簡單重復(fù)序列重復(fù)單位數(shù)不同的DNA區(qū)域的多態(tài)性，這也是SSR技術(shù)較其它幾。種分子標(biāo)記技術(shù)更適合于玉米研究的原因之一。

1．2 SSR標(biāo)記的類型

按照重復(fù)單位的堿基數(shù)可將微衛(wèi)星分為1～6核苷酸重復(fù)類型，其中二核苷酸重復(fù)有4種類型：(AT)n／(TA)n、(AG)n／(TC)n、(AC)n／(Gt)n、(GC)n／(CG)n；三核苷酸重復(fù)有10種類型：(AAT)n)/(TAT)n、(AAG)n／(TCT)n、(AAC)n／(TGT)n、(ATG)n／(TCA)n、(AGT)n／(TAC)n、(AGG)n／(TCC)n、(AGC)n／(TGC)n、(ACG)n／(TCG)n、(ACC)n／(TGG)n、(GGC)n／(CGC)n；四核苷酸重復(fù)類型有32種(Jurke，1995)。所有類型的微衛(wèi)星中以單核苷酸重復(fù)和二核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星在基因組中出現(xiàn)的頻率最高。同一重復(fù)類型中不同的堿基重復(fù)多態(tài)性也不一致。

另外，Weber(1990)按照微衛(wèi)星核心序列結(jié)構(gòu)的不同將微衛(wèi)星標(biāo)記分為三種類型：(1)完全型(perfect)，指核心序列以不間斷的重復(fù)方式構(gòu)成的微衛(wèi)星；(2)不完全型(imperfect)，指在微衛(wèi)星的核心序列之間有幾個(gè)非重復(fù)堿基，但其兩端的連續(xù)重復(fù)的核心序列重復(fù)次數(shù)大于3；(3)復(fù)合型(compound)，指兩種或兩種以上的串聯(lián)核心序列由幾個(gè)連續(xù)的非重復(fù)堿基分隔開，但各種連續(xù)性的核心序列重復(fù)次數(shù)不少于5。

1．3 SSR的功能

SSR在真核生物基因組中的功能一直存在爭議。在植物基因組中，大多數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列是非編碼的，所以長期以來人們一直認(rèn)為SSR是一類“垃圾”DNA，是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒有明確的生理功能。隨著研究的深入，有關(guān)SSR功能的資料在不斷積累�？偟膩碚f，SSR的功能主要有以下幾個(gè)方面：有些SSR(通常為4～7個(gè)堿基重復(fù)型)存在于結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)，并且編碼氨基酸；染色體末端的SSR有保護(hù)DNA完整性，避免降解、融合及丟失的功能；位于DNA調(diào)控區(qū)的SSR有提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率的作用；SSR區(qū)可能是基因重組的熱點(diǎn)，是基因變異的來源；部分SSR具有產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物或活化染色體的功能。所以人們相信，盡管大多數(shù)SSR確實(shí)沒有明確的生理功能，只是采取了某種策略來確保自身存活，但部分SSR序列確實(shí)是功能基因的一部分。

目前，已知至少有10種以上的人類遺傳疾病都與微衛(wèi)星序列的突變有關(guān)。在引起這些疾病的相關(guān)基因附近、內(nèi)含子或外顯子中，一般含有三核苷酸微衛(wèi)星序列，其中患者中所攜帶的這些微衛(wèi)星序列往往不穩(wěn)定，而且長度通常比正常人的更長。在植物中也發(fā)現(xiàn)了一些性狀與微衛(wèi)星序列長度變化密切相關(guān)。例如，水稻6號(hào)染色體上的Wx基因編碼一種淀粉合成酶，它與水稻胚乳中直鏈淀粉的合成有關(guān)。在Wx基因的5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)有1個(gè)微衛(wèi)星序列(CT)n，該序列的長度與不同品種的直鏈淀粉含量高低具有明顯的相關(guān)性。一般認(rèn)為，微衛(wèi)星序列可能在基因的表達(dá)調(diào)控、染色體結(jié)構(gòu)、染色體重組、新基因的起源及演化等方面有著重要的意義。

1．4 SSR標(biāo)記的引物來源

微衛(wèi)星DNA分析成功與否的關(guān)鍵因素有兩個(gè)，一是PCR擴(kuò)增的效果，另一個(gè)就是側(cè)翼序列引物的來源。一般來說，微衛(wèi)星擴(kuò)增的引物來源有四個(gè)：一是直接應(yīng)用已發(fā)表的微衛(wèi)星DNA引物；二是使用近緣種的引物；三是通過篩選DNA序列數(shù)據(jù)庫，或篩選克隆文庫的簡單重復(fù)DNA序列，借助于計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；四是最好也是最根本的方法，即構(gòu)建基因組文庫，再根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)兩翼的序列來設(shè)計(jì)引物。